Calcein AM

 

Produktnamn	Katt.Inga.	Spec..
Calcein AM	G1728-0.1ML	0.1 mL

 

 

Calcein AM (Calcein acetoximethyl ester), är baserad på Calcein med införandet av acetoximethyl ester (AM) grupp, vilket ökar hydrofobiciteten, så att det lätt kan penetrera membranet i de levande cellerna. Calcein AM i sig är en cellgenomsläpplig, icke-fluorescerande och hydrofob förening som vid inträde i cellen hydrolyseras av endogena esteraser i cellen för att producera den starkt negativt laddade polära molekylen Calcein som inte kan tränga igenom cellmembranet, och därmed är kvarhålls i cellen, medan Calcein (maximal excitationsvåglängd: 494 nm; maximal emission våglängd: 517 nm) kan avge stark grön fluorescens. Jämfört med andra liknande prober (t.ex. BCECF AM och CFDA AM) är Calcein AM för närvarande en av de mest idealiska fluorescerande sonderna för färgning av levande celler på grund av dess mycket låga cytotoxicitet, praktiskt taget ingen effekt på cellulära funktioner såsom cellproliferation eller lymfocytkemotaxi, och låg pH-känslighet.

På grund av bristen på esteras i döda celler används Calcein AM endast för livsduglighetstestning och korttidsmärkning av levande celler. Det röda fluorescerande nukleinsyrafärgämnet Propidium Jodide (PI) penetrerar inte cellmembranet i levande celler, det passerar genom det oordnade området av det döda cellmembranet till kärnan och bäddar in sig i cellens DNA-dubbelhelix för att producera en röd fluorescens ( excitation: 535 nm, emission: 617 nm), därför färgar PI endast döda celler. Calcein AM används ofta i kombination med propidiumjodid (PI) för samtidig dubbelfluorescensfärgning av levande och döda celler. Eftersom både Calcein och PI-DNA kan exciteras vid 490 nm, kan levande och döda celler observeras samtidigt med fluorescensmikroskopi. Med 545 nm excitation kan endast döda celler observeras.

Calcein AM kan användas i de flesta däggdjursceller. Det har visats att Calcein AM kan användas i vissa växtceller som Arabidopsis rotkantsliknande celler och vissa jästsvampar som Pichia anomala och Saccharomyces cerevisiae. Vissa parasiter som Leishmania kan inte komma in i levande celler på grund av cellmembrankomponenter, men Calcein AM kan komma in i parasitceller i de tidiga stadierna av apoptos, och används därför tillsammans med PI för detektering av parasiter i de tidiga stadierna av apoptos. Calcein AM är inte lämpligt att använda på svampar och bakterier eftersom de har cellväggar som hindrar Calcein AM från att komma in i cellerna.

Calcein i sig är en metallkomplexbildningsindikator, och den fluorescerande signalen dämpas när den komplexbinds med metalljoner som Co²⁺, Ni²⁺Cu²⁺, Fe³⁺och Mn²⁺vid fysiologiskt pH, vilket gör Calcein AM också till en grön fluorescerande sond som kan användas för att bestämma den mitokondriella permeabilitetsövergångsporen.

Denna produkt, Calcein AM, är av hög renhet och löst i vattenfri DMSO i en koncentration av 2 mM. Den vanligaste slutkoncentrationen av Calcein AM är 0.1-5.0 μM. För att få ett mer önskvärt resultat, vänligen justera den slutliga koncentrationen av Calcein på lämpligt sätt i enlighet med typen av celler och den faktiska situationen för experimentet.

 

 

-20 grad för lagring och transport, giltig i 12 månader.

 

 

Komponent	G{0}.1ML
Calcein AM	0.1 mL
Manuell	1 st

 

 

Calcein AM-färgningsarbetslösning framställdes:

Späd produkten med en lämplig buffert, såsom serumfritt odlingsmedium, HBSS (G4203) eller PBS (G4202), för att framställa en Calcein AM-färgningsarbetslösning i en koncentration av 0.1-5,0 µM.

Obs: Den slutliga koncentrationen av Calcein AM rekommenderas att justeras på lämpligt sätt enligt celltypen och experimentella verkligheten.

 

Förfaranden

1. Fluorescensmikroskopanalys eller fluorescenszymografianalys för suspensionsceller:

a) Celler räknades efter vissa behandlingar enligt den experimentella designen. Ta lämpliga celler och centrifugera dem vid 250 × g i 5 minuter vid rumstemperatur, kassera supernatanten och tillsätt lämplig volym Calcein AM-färgningsarbetslösning för att göra celldensiteten cirka 1 × 10⁶/ml.

b) Inkubera cellerna vid 37ºC i 30-45 min, den optimala inkubationstiden är olika för olika celler. Betrakta 30 min som den initiala inkubationstiden och optimera den enligt den specifika experimentella situationen för att få mer idealiska detektionsresultat.

c) Vid slutet av inkubationen, centrifugera vid 250×g i 5 minuter, aspirera supernatanten och återsuspendera cellerna långsamt genom att tillsätta 37ºC förvärmt odlingsmedium.

d) Upprepa steg c två eller flera gånger för att tvätta ordentligt för att avlägsna kvarvarande färgningslösning.

e) Byt ut det färska 37ºC förvärmda odlingsmediet och inkubera vid 37ºC i ytterligare 30 minuter borta från ljus för att säkerställa att de intracellulära esteraserna hydrolyserar Calcein AM tillräckligt för att producera Calcein med grön fluorescens.

f) Cellerna centrifugerades vid 250×g i 5 minuter vid rumstemperatur, det mesta av odlingsmediet aspirerades och cellerna återsuspenderades med det återstående odlingsmediet och smetades ut och observerades sedan under ett fluorescensmikroskop eller detekterades med en fluorescens zymografi. Den maximala excitationsvåglängden för Calcein är 494 nm, och den maximala emissionsvåglängden är 514 nm. Vid behov kan annan fluorescens-återfärgning utföras, och hela processen bör undvikas genom lätt operation.

 

2. Fluorescensmikroskopianalys av vidhäftande celler eller fluorescensenzymmärkningsanalys:

a) Celler inokulerades på petriskålar, cellodlingsplattor med flera brunnar eller cellsökare och behandlades på vissa sätt enligt den experimentella designen.

b) Aspirera odlingslösningen och tvätta cellerna 1-2 gånger med PBS.

c) Tillsätt en lämplig volym Calcein AM-färgningslösning och skaka försiktigt så att färgen täcker alla celler jämnt. I allmänhet är volymen av 96-brunnsplatta 100 ul per brunn, 24-brunnsplatta är 250 ul per brunn, 12-brunnsplatta är 500 ul per brunn och 6- brunnsplatta är 1 ml per brunn.

d) Inkubera vid 37ºC i 30-45 min, den optimala inkubationstiden varierar för olika celler. Ta 30 minuter som den initiala inkubationstiden och optimera inkubationstiden enligt de celler som används för att få en mer idealisk färgningseffekt.

e) Vid slutet av inkubationen ersattes odlingsmediet med färskt förvärmt odlingsmedium vid 37ºC och inkuberades vid 37ºC i ytterligare 30 minuter bort från ljus för att säkerställa att det intracellulära esteraset hydrolyserade Calcein AM tillräckligt för att producera Calcein med grön fluorescens .

f) Aspirera odlingsvätskan, tvätta med PBS i 2-3 gånger och tillsätt sedan den serumfria cellodlingsvätskan som kan observeras under ett fluorescensmikroskop eller detekteras med fluorescerande enzymmarkör. Calcein har en maximal excitationsvåglängd på 494 nm och en maximal emissionsvåglängd på 514 nm, och kan färgas ytterligare med andra fluorescerande ämnen om så önskas, hålla hela processen borta från ljus.

 

3. Flödescytometrianalys:

a) Efter trypsindigestion av vidhäftande celler, återsuspendera cellerna i odlingsmedium, suspendera cellerna för direkt användning, räkna, centrifugera en lämplig mängd celler vid 250×g i 5 minuter vid rumstemperatur, kassera supernatanten och tillsätt en lämplig volym Calcein AM-färgningsarbetslösning så att cellerna är en encellssuspension och cellernas densitet är ungefär 1×106/ml, med en volym på 1 ml för varje prov. OBS: Det är nödvändigt att förbereda ett endast buffertprov av cellerna för användning som en negativ kontroll i flödescytometrianalysen. negativ kontroll för flödescytometrianalysen, och det är önskvärt att behålla denna buffert på samma sätt som bufferten som används för att bereda Calcein AM-färgningsarbetslösningen.

b) Inkubera i 30 minuter vid 37ºC borta från ljus.

c) Efter att inkubationen avslutats, samlades celler upp genom centrifugering vid 250 x g under 5 minuter vid rumstemperatur. Tillsätt 1 ml buffert per prov, återsuspendera försiktigt och samla upp cellerna genom centrifugering vid 250 × g i 5 minuter vid rumstemperatur. Obs: Detta steg tar bort överflödigt färgämne och reagens som kan orsaka fluorescenssläckning.

d) Resuspendera celler med 400 µl buffert. Ytterligare färgning kan också utföras vid behov. Observera att hela processen bör göras borta från ljus. Efter färgning placeras proverna på is och kan flödescytometriskt detekteras och analyseras inom 1 timme.

e) Observera att endast buffert och ofärgade cellprover användes för den negativa kontrollinställningen av flödescytometern. Calcein har en maximal excitationsvåglängd på 494 nm och en maximal emissionsvåglängd på 514 nm.

 

 

1. Alla fluorescerande färgämnen har släckningsproblem och försiktighet måste iakttas för att undvika ljus så mycket som möjligt för att bromsa fluorescenssläckningen.

2. Calcein AM är mycket känsligt för fukt och tenderar att sönderfalla i fuktiga miljöer, därför måste Calcein AM-lösningen förslutas tätt med locket efter varje uttag. Det rekommenderas att förvara i separata förseglade förpackningar enligt engångsdosen. Använd inte vattenhaltiga pipettspetsar.

3. Eftersom Calcein AM inte är stabilt i vattenhaltiga lösningar som PBS, måste färgningsarbetslösningen förberedas och användas nu.

4. Serum och fenolrött i odlingsmediet har en effekt på Calcein AM-färgning, och det rekommenderas att cellerna tvättas tillräckligt innan Calcein AM-arbetslösning tillsätts.

5. Calcein AM-märkta celler med enhetlig fluorescens är ett bra val för cellspårning och allmän cytoplasmatisk färgning, men det binder inte till någonting och kan aktivt dras tillbaka från cellen inom några timmar, och retention av kalcein i levande celler beror på de inneboende egenskaperna hos celltypen och odlingsförhållandena.

6. Calcein AM-färgning bör inte följas av aldehydfixering, annars kommer Calcein att gå förlorat under fixeringen. Dessutom kommer varje störning av plasmamembranet (t.ex. avkalkningsmedel eller trypsinbehandling) att resultera i färgläckage från cellerna.

7. Om Calcein AM har svårt att komma in i cellerna kan ett ytaktivt ämne som Pluronic F127 användas. En lösning av Calcein AM i en koncentration av 1/10 kan också användas istället för odlingsmedium.

8. Denna produkt är begränsad till vetenskaplig forskning av professionella och får inte användas för diagnostiska procedurer eller behandling, mat eller medicin, eller förvaras i en vanlig bostad.

9. För din säkerhet och hälsa, vänligen bär labbrock och engångshandskar.

 

Endast för forskning!

 

 

Populära Taggar: calcein am, Kina calcein am tillverkare, leverantörer, fabrik