Immunutfällningskit (Protein G magnetiska pärlor)

 

Produktnamn	Katt. Inga.	Spec.
Immunutfällningskit (Protein G magnetiska pärlor)	G2210-50T	50 T

 

 

IP eller Co-IP är en vanlig experimentell teknik för att studera protein- eller protein-protein-interaktioner (PPI) genom att använda specifika antikroppar och ett medium som binder antikroppar (t.ex. Protein A/G Agarose eller Protein A/G Magrose), eller direkt med hjälp av en medium kopplat med specifika antikroppar (t.ex. agarosgeler eller magnetiska pärlor), och sedan isolera antigen-antikroppskomplexen från de komplicerade proteinproverna genom centrifugering eller magnetisk kraft, så för att uppnå syftet med isolering och rening av målproteinerna, som därefter kan användas för Western blot eller masspektrometri. Protein A är ett cellväggsytprotein som finns i Staphylococcus aureus med en molekylvikt på 42 kDa. Protein G är ett immunglobulinbindande protein uttryckt av streptokockbakterier typ C eller G. Protein A och Protein G är funktionellt lika och kan binda specifikt till däggdjursimmunoglobulin (Ig). Rekombinant protein A och G med lämpliga modifieringar bundna till magnetiska pärlor kan användas för immunoutfällning eller antikroppsrening. Protein A magnetiska pärlor är lämpliga för immunoutfällning av humant IgG1, IgG2, IgG4, mus IgG2a, IgG2b, medan Protein G magnetiska pärlor är lämpliga för immunoutfällning av humant IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, mus IgG2, IgGb, IgGb , råtta IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG2c polyklonala antikroppar. (Se schema I för specifik information)

Denna produkt antar de egenutvecklade och producerade protein A-proteinmärkta magnetiska pärlorna, jämfört med liknande produkter på marknaden, denna produkt binder antikroppar mer effektivt och har en lägre ospecifik bindningshastighet, tillsammans med den optimerade bufferten, kan den bekväm och effektiv för immunoutfällningsexperiment; den kan användas i stor utsträckning vid isolering och rening av målproteinerna i prover såsom cellysat, cellulär sekretionssupernatanter, serum, ascites, etc.; Detta kit tillhandahåller två elueringsmetoder (denaturerande eluering och sur eluering) för att eluera målproteinet, speciellt syraelueringen kommer inte att innehålla antikroppens lätta och tunga kedjor, vilket effektivt kan lösa problemet med interferensen av antikroppens tunga och lätta kedjor i immunoutfällnings- och proteinimmunoblotting-experimenten.

 

 

Egenskaper	Beskrivning
Produktinnehåll	50mg/ml magnetiska pärlor i specifik skyddsbuffert
Magnetisering	Superparamagnetism
Kopplat protein	Proteiner G
MW av protein	~25 kDa (protein G)
Bindande proteinkapacitet	>1mg musantikropp per ml pärlor
Specificitet	Antikroppar från olika arter, inklusive möss, människor, råttor, getter, får och nötkreatur
Pärldiameter	30~150 μm
Elueringsmetoder	Eluering med syra eller 1x SDS-PAGE-laddningsbuffert (reducerad) Obs: Om den elueras med 1x SDS-PAGE-laddningsbuffert (reducerad), kommer antikroppens tunga kedja (~ 50 kDa) och lätta kedjan (~ 25 kDa) att denatureras och frigöras från de magnetiska pärlorna.
Ansökningar	IP, Co-IP, Proteinrening

 

 

Fartyg med våt is; 5×SDS-PAGE laddningsbuffert (reducerad) bör lagras vid -20 grad och annan vid 2-8 grad i 12 månader.

 

 

Komponentnummer	Komponent	G2210-50T	Förvaringstemperatur
G2038	IP-lysbuffert	50 ml	2-8 grad
G0015	10×TBS	5 ml	2-8 grad
G2210-1	SweMagrose Protein G	1 ml	2-8 grad
G2209-2	Syraelueringsbuffert	10 ml	2-8 grad
G2209-3	Neuliseringselueringsbuffert	1 ml	2-8 grad
G2013	5x SDS-PAGE-laddningsbuffert (reducerad)	1 ml	-20 grad
Manuell		1 st

 

 

Produktnamn	Katt. Antal	Spec.
50×Cocktailproteashämmare	G2006-250UL	250 μL
PBS,1×(fosfatbuffrad saltlösning)	G4202-500ML	500 ml

 

 

1. Förberedelse av satsen

a) Se tabellen nedan, förbered relevanta reagenser i ett förhållande av 100-500 μL lysat per prov.

Steg	Lösning krävs	Volym	Volym
Celllys och beredning	IP-lysat som innehåller Cocktailproteashämmare	100 μL	500 μL
IP	SweMagrose Protein G	4 μL	20 μL
Tvätta tre gånger	1×TBS	100 μL	500μL
Syraeluering och neutralisering	Syraelueringsbuffert	20 μL	100 μL
	Neutraliseringsbuffert	20 μL	100 μL
Denaturerande eluering	1×SDS-PAGE laddningsbuffert (reducerad)	20 μL	100 μL

b) Beredning av IP-lysat innehållande proteashämmare: Se tabellen ovan, använd {{0}} μL IP-lysat innehållande proteashämmare per 0,5-1 miljoner celler för lysering; blanda IP-lysatet med 50x Cocktailproteashämmare (G2006-250UL rekommenderas) i ett förhållande av 50:1, tillsätt till exempel 20 μL 50x Cocktailproteashämmare i 1 mL IP-lysat, sedan 1 mL av IP-lysat innehållande proteashämmare kommer att erhållas; det preparerade IP-lysatet som innehåller inhibitorn ska placeras i ett isbad eller vid 4 grader.

c) Notera: Om målproteinet för immunoutfällningen involverar fosforylering eller acetyleringsmodifiering, bör fosfatashämmare eller deacetylashämmare tillsättas (självförsörjande); IP-lysat innehållande inhibitor bör beredas före användning och bör inte frysas och behållas för efterföljande användning.

d) Beredning av 1×TBS: Späd 10×TBS-buffert med ultrarent vatten till 1×TBS. Tillsätt till exempel 1 mL 10 × TBS-buffert till 9 mL ultrarent vatten, vilket är 1 × TBS-buffert efter att ha blandat väl.

e) Framställning av 1x SDS-PAGE-laddningsbuffert (reducerad): en lämplig mängd 5x SDS-PAGE-laddningsbuffert (reducerad) späddes 5 gånger med ultrarent vatten för att göra 1x SDS-PAGE-laddningsbuffert (reducerad); blanda till exempel 0.2mL 5x proteinbuffert (reducerad) med 0.8 mL ultrarent vatten, vilket är 1x SDS-PAGE-laddningsbuffert (reducerad).

2. Beredning av antigenprov

Immunfällnings- eller immunfällningsexperiment bör utföras omedelbart efter att proverna lyserats, om inte kan proverna förvaras i kylskåp vid -20 grad eller -80 grad, men frysning och upptining kan påverka protein-proteininteraktioner; alla provlyssteg bör utföras i ett isbad eller vid 4 grader för att minimera nedbrytningen av protein, och en viss mängd av provet bör tas som en ingång eller en total efter att provet har förberetts för efterföljande detektering av Western Blot.

För vävnadsprover:

a) Vävnaderna ska sköljas i förkallt PBS för att ta bort överflödigt blod noggrant. Väg och hacka till små bitar i homogenisator på is.

b) Tillsätt IP-lysatet som innehåller proteashämmare i ett förhållande av 100-200 μL per 10-20 mg vävnad, eller minska mängden IP-lysat om högre koncentrationer av protein krävs.

c) Homogenisera med en glashomogenisator eller handhållen homogenisator, eller använd vår egenutvecklade KZ-III-F lågtemperaturkvarn för full slipning.

d) Homogenatet överfördes till ett 1,5 ml centrifugrör, skakades och blandades och isbadades i 30 minuter, blåstes upprepade gånger med en pipett var 10:e minut för att säkerställa fullständig lysis av vävnadscellerna.

e) Centrifugera vid 12,000 xg i 5 minuter vid 4 grader, kassera fällningen och aspirera supernatanten för efterföljande immunoutfällnings- eller immunoutfällningsexperiment.

För vidhäftande cellprov:

a) Vid behov kan cellerna tvättas 2-3 gånger med PBS, absorbera restvätskan noggrant vid sista gången.

b) Skrapa cellerna med en cellskrapa eller trypsindigererade cellerna för att göra dem helt suspenderade, samla upp dem i ett 1,5 ml centrifugrör och centrifugera vid 1,000 xg i 5 minuter vid 4 grader, kassera supernatanten för att samla upp cellfällningen.

c) Tillsätt {{0}} μL IP-lysat som innehåller proteashämmare per 0.5-1 miljoner celler (motsvarande en brunn i en 6-brunnsplatta); blås på lämpligt sätt och isbad i 3-5 min för att helt lysera cellerna, och det bör inte finnas någon tydlig cellutfällning efter fullständig lysering; om mängden celler är större, rekommenderas att cellerna delas upp i 0,5-1 miljoner celler/rör för fullständig lysering.

d) Efter tillräcklig lysis, centrifugera vid 12,000 xg i 5 minuter vid 4 grader, kassera fällningen och aspirera supernatanten för efterföljande immunoutfällnings- eller immunoutfällningsexperiment.

För suspendera cellprover:

a) Centrifugera vid 1000 g i 5 minuter vid 4 grader för att samla upp fällningen; om nödvändigt, tvätta en gång med PBS, aspirera sedan den kvarvarande vätskan och vortexa eller snärta försiktigt med botten av röret för att sprida cellerna så mycket som möjligt.

b) Tillsätt {{0}} μL IP-lysat innehållande proteashämmare per 0.5-1 miljoner celler (motsvarande en brunn i en 6-brunnsplatta); blås på lämpligt sätt och isbad i 3-5 min för att helt lysera cellerna; om mängden celler är större, rekommenderas att cellerna delas upp i 0,5-1 miljoner celler/rör för fullständig lysering.

c) Isbad i 5 min, centrifugering vid 12000 g 4 grader i 5 min, ta supernatanten, det vill säga den totala proteinlösningen, som kan användas för efterföljande immunoutfällnings- eller immunoutfällningsexperiment och så vidare.

För bakterie- eller jästprover:

a) Ta 1 mL bakterie- eller jästlösning och centrifugera för att avlägsna supernatanten. Vid behov kan cellerna tvättas en gång med PBS, absorbera restvätskan ordentligt vid sista gången. Vortexa eller snärta försiktigt med botten av röret för att skingra cellerna så mycket som möjligt.

b) Tillsätt 100-200 μL IP-lysat som innehåller proteashämmare och blås försiktigt för att helt skingra bakterierna eller svamparna.

c) Isbad i 10 minuter, för bättre lysering, kan bakterier och jäst smältas med lysozym respektive väggbrytande enzym (självförsörjande) och sedan lyseras med IP-lysat innehållande proteashämmare.

d) Centrifugera vid 12,000 xg i 5 minuter vid 4 grader, kassera fällningen och aspirera supernatanten för efterföljande immunoutfällnings- eller immunoutfällningsexperiment.

3. Beredning av magnetiska pärlor

a) Resuspendera försiktigt SweMagrose Protein G magnetiska pärlor för att bilda en homogen pärldispersion så mycket som möjligt, tillsätt 20 ul välblandad pärldispersion för varje 500 ul prov, ta en lämplig mängd magnetiska pärlor i ett rent EP-rör och tillsätt 1x TBS till en slutlig volym på 0,5 ml (20 ul pärldispersion för varje prov används i följande immunoutfällningssteg som ett exempel).

b) Återsuspendera försiktigt de magnetiska pärlorna, placera på ett magnetiskt separationsställ i 30 s, ta försiktigt bort supernatanten och upprepa stegen ovan två gånger.

c) De magnetiska pärlorna återsuspenderades med 1x TBS enligt volymen av den initiala pärldispersionen.

4. Antikroppsbindning till SweMagrose Protein G magnetiska pärlor

a) Antikroppsberedning: späd antikroppen med 1x TBS för att bereda antikroppsarbetslösningen enligt utspädningsförhållandet som rekommenderas i antikroppsinstruktionerna, eller förbered antikroppen till en antikroppsarbetslösning med en slutlig koncentration på 5-50 ug/mL , som kan tillagas på is; valfritt: använd normalt IgG av samma antikroppsart för att bereda normal IgG-arbetslösning med samma utspädningsförhållande eller slutkoncentration på 5-50 ug/mL, ta bort ospecifik bindning eller fungera som en negativ kontroll. Det normala IgG från samma art betyder att om antikroppen som används i efterföljande immunoutfällning är mus-IgG, kan en lämplig mängd normalt mus-IgG spädas med 1x TBS i detta steg för att minska bakgrunden eller som en negativ kontroll.

b) Antikroppsadsorption: Separera SweMagrose Protein G magnetiska pärlor framställda i steg 3 med magnet, aspirera supernatanten, tillsätt 500 μL antikroppsarbetslösning eller normal IgG-arbetslösning, återsuspendera och inkubera sedan i 15-60 min vid rumstemperatur på en omsättningsblandare.

Obs: Det är också möjligt att inkubera SweMagrose Protein G magnetiska pärlor framställda i steg 3 direkt med en lämplig mängd antikropp eller normalt IgG.

c) Magnetisk separation och tvättning: Separera de inkuberade pärlorna med magnet, aspirera supernatanten, tillsätt 500 μL 1×TBS, återsuspendera SweMagrose Protein G-pärlorna genom att försiktigt blåsa med en pipett, placera på ett magnetiskt separationsställ i 10 s, ta bort supernatanten, upprepa tvättningen tre gånger och återsuspendera pärlorna med 1×TBS i samma mängd som den initiala volymen.

Obs: Om pärlorna är agglomererade eller flagnande under inkubation och tvättning är det ett normalt fenomen och kommer inte att påverka experimentresultaten.

5. Immunfällning (IP):

a) Avlägsnande av icke-specifik bindning (valfritt): SweMagrose Protein G-pärlorna framställda i steg 4, som binder normalt IgG, inkuberas med proverna vid 4 grader i 60 minuter och separeras med magnetsug, och supernatanterna används för de efterföljande experimenten; Syftet med detta steg är att ta bort de proteiner som binder ospecifikt till normalt IgG.

b) Inkubation av prover med SweMagrose Protein G-pärlor konjugerade med antikropp eller normalt IgG: tillsätt SweMagrose Protein G-pärlor konjugerade med antikropp eller normalt IgG i förhållandet 20 ul pärlsuspension för varje 500 ul proteinprov, placera på en sida- oscillerande shaker eller en roterande mixer, och inkubera i 2 timmar vid rumstemperatur eller över natten vid 4ºC.

Anmärkning 1: Om pärlorna är agglomererade eller flagnande under inkubation och tvättning är det ett normalt fenomen och kommer inte att påverka experimentresultaten.

Not 2: Alternativt kan lämplig mängd antikropp eller normalt IgG inkuberas med provet i 1-2 timmar i rumstemperatur eller över natten vid 4 grader, och sedan kan 10-20 μL av magnetisk pärlsuspension tillsättas och inkuberades i 60 minuter vid rumstemperatur.

c) Magnetisk separation: efter inkubation, placera på ett magnetiskt separationsställ i 10 sekunder för att avlägsna supernatanten.

Obs: Behåll en del av supernatanten för att testa effekten av immunoutfällning.

d) Tvätta: Tillsätt 500 ul 1×TBS, blås försiktigt de återsuspenderade pärlorna med en pipett, placera på en magnetisk separator i 10 sekunder för att avlägsna supernatanten och upprepa tvättningen tre gånger.

Obs: Du kan också testa OD280 för tvättlösningen för att avgöra om tvätten är klar, om OD280 är mer än 0,05 bör antalet tvätttider ökas på lämpligt sätt.

6. Eluering

Beroende på egenskaperna hos målproteinet och kraven för efterföljande experiment, kan en av följande metoder väljas för eluering.

a) Denaturerande elueringsmetod: Prover eluerade med denna metod är lämpliga för SDS-PAGE. Ta bort EP-röret från den magnetiska separatorn, tillsätt 25 µL 1× proteinprovtagningsbuffert (reducerad) till röret, värm vid 95 grader i 5 minuter och utför sedan en magnetisk separation för att samla upp supernatanten för Western blot-detektion.

b) Syraeluering: Provet som elueras med denna metod behåller sin ursprungliga biologiska aktivitet och kan användas för postfunktionell analys. Ta bort EP-röret från det magnetiska separationsstället, tillsätt 20 µL syraelueringsbuffert till röret, blanda väl och inkubera vid rumstemperatur i 10 minuter, utför sedan en magnetisk sugseparation, samla upp supernatanten i ett nytt EP-rör och omedelbart tillsätt 2 µL neutraliseringselueringsbuffert för att justera pH för den eluerade produkten till neutral, vilket kan användas för postfunktionell analys.

Obs: Användaren kan justera mängden tillsatt elueringsbuffert enligt önskad volym.

 

 

1. Förvara inte SweMagrose Protein A i kitet vid -20 grader eller frys och tin upp upprepade gånger, annars kommer det att påverka prestandan hos magnetiska pärlor och orsaka onödiga experimentella fel.

2. Läs dessa instruktioner noggrant innan du utför immunoutfällningsproceduren.

3. Magnetisk separationsram för magnetisk separation behöver självförsörjande

4. Om det immunutfällda målproteinet involverar fosforylering eller acetyleringsmodifiering, bör lämpliga fosfatashämmare och deacetylashämmare tillhandahållas.

5. Håll pärlorna vid pH 6-8, undvik höghastighetscentrifugering, torkning eller frysning; utsätt inte pärlorna för magnetiska fält under långa tidsperioder, vilket kan orsaka agglomerering av pärlorna.

6. Pärlorna ska blandas noggrant före användning, blandningen ska vara skonsam och får inte utsättas för våldsam virvling och skakning för att undvika denaturering av antikroppen.

7. Positiva och negativa kontroller (SweMagrose Mouse IgG) rekommenderas vid immunoutfällning.

8. Proteinprover bör renas så snart som möjligt efter insamling och alltid placeras vid 4 grader eller i ett isbad för att bromsa proteinnedbrytning eller denaturering

9. Magnetiska pärlor kan samlas vid användning med syraeluering, vilket är ett normalt fenomen och inte påverkar normal användning av magnetiska pärlor.

10. 10. Denna produkt är begränsad till vetenskaplig forskning av yrkesverksamma och får inte användas för klinisk diagnos eller behandling, mat eller medicin, eller förvaras i en vanlig bostad.

11. Bär lämpliga skyddskläder såsom laboratorieoveraller, skyddsglasögon och handskar.

12. Bindningskapaciteten för Protein A och Protein G till antikroppar av olika generiska källor och subtyper visas i Tabell I.

 

Tabell 1

Art	Ig	Protein A	Proteiner G	Totalt Ig	Protein A	Proteiner G
Mänsklig	IgGl	++++	++++	Mänsklig	++++	++++
	IgG2	++++	++++	Mus	+++	+++
	IgG3	-	++++	Råtta	+/-	++
	IgG4	++++	++++	Kanin	++++	+++
	IgA	++	-	Get	-	++
	IgD	++	-	Kyckling	-	+
	IgE	++	-	Ko	++	++++
	IgM	++	-	Marsvin	++++	++
Mus	IgGl	+	++++	Hamster	+	++
	IgG2a	++++	++++	Häst	++	++++
	IgG2b	+++	+++	Gris	+++	+++
	IgG3	++	+++	Får	+/-	++
	IgM	+/-	-	++++: Stark Bing
Råtta	IgGl	-	+	++~+++:Mediumbindning
	IgG2a	-	++++	+:Svag bindning
	IgG2b	-	++	+/-: Svag eller ingen bindning
	IgG2c	+	++	-:Ingen bindning
	IgM	+/-	-

 

Endast för forskningsanvändning.

 

 

Populära Taggar: immunutfällningskit (protein g magnetiska pärlor), Kina immunfällningskit (protein g magnetiska pärlor) tillverkare, leverantörer, fabrik