Åldrande cell-galaktosidasfärgningskit

 

Produktnamn	Kat.nr.	Spec.
Åldrande cell-galaktosidasfärgningskit	G1073-100T	100 T

 

 

Delningsförmågan hos de flesta normala celler är begränsad. När de inte kan dela sig går de in i ett åldrande tillstånd, vilket kallas cellåldring. Cellåldring är garantimekanismen för en cell att kontrollera sin tillväxtpotential, vilket i allmänhet betyder replikativ åldrande. Normala celler slutar dela sig efter ett begränsat antal delningar och irreversibel tillväxtstopp inträffar. Vid denna tidpunkt är cellerna fortfarande vid liv, men det finns betydande förändringar i cellmorfologi och fysiologisk metabolisk aktivitet, vanligtvis representerad av större cellvolym och aktivering av -galaktosidas associerad med åldrande. -galaktosidas är ett hydrolytiskt enzym i celllysosomer. Den är vanligtvis aktiv vid pH 4.0, men den är aktiv vid pH 6.0 i åldrande celler. Detta kit är baserat på detta fenomen och princip för att färga åldrande vävnader eller celler mot uppregleringen av -galaktosidasaktivitetsnivån i samband med åldrande. Den specifika reaktionsprincipen är att X-Gal används som substrat, och åldrande cellspecifikt -galaktosidas katalyserar substratet för att generera blå produkt, som representeras av blått sediment i cellens cytoplasma, vilket kan observeras under ljusmikroskopet . Enligt beräkningen att mängden färgningslösning för varje prov är 1 mL, kan satsen slutföra färgningen av 100 prover.

 

 

Transport av våt is; Förvaras i 2-8 grad borta från ljus, giltigt i 12 månader. Om X-Gal-pulver bereds till en lösning delas det i små delar och lagras i -20 grad, vilket är effektivt inom 3 månader.

 

 

Komponentnummer	Komponent	G1073
G1073-1	-galaktosidasfärgningsfixeringslösning	100 ml
G1073-2	-galaktosidasfärgningslösning A	100 ml
G1073-3	-galaktosidasfärgning B	1,2 ml
G1073-4	DMF (dimetylformamid)	5 ml
G1073-5	X-Gal (pulver)	100 mg

 

 

Beredning av reagens

1. Förbered din egen PBS-buffert (G4202 rekommenderas).

2. 100 mg X-Gal-pulver löstes helt upp och blandades med 5 mL DMF (dimetylformamid) och delades sedan upp i 1,5 mL rena centrifugrör, 0,5 mL för varje rör, och förvarades vid {{8} } grad bort från ljus. Undvik upprepad frysning och upptining.

3. Beredning av -galaktosidasfärgningslösning enligt proportionen i tabellen nedan. För celler odlade i 6-brunnsplattor krävs 1.0-1,5 mL färgningsarbetslösning per brunn, och för 12-brunnsplattor, 0.{{8 }}.0 mL färgningslösning krävs per brunn. Färgningslösningen bereddes enligt provstorleken för att undvika spill.

 

Component	Volym
-galaktosidasfärgningslösning A	940 μL
-galaktosidasfärgning B	10 μL
X - Gal lösning	50 μL
Total volym	1 ml

 

 

1. För vidhäftande celler

(1) De odlade cellerna (eller cellkrypningsarken) i 6-brunnsplattor aspirerades och cellodlingsmediet avlägsnades, tvättades två gånger med PBS och 1 ml -galaktosidasfärgningsfixeringslösning tillsattes, och cellerna fixerad i 15 minuter vid rumstemperatur.

(2) Den fixerade lösningen kasserades och cellerna tvättades med PBS under 3 gånger, 2 minuter varje gång.

(3) PBS avlägsnades genom sugning med en pipett, och 1 ml av -galaktosidasfärgande arbetslösning sattes till varje brunn och inkuberades vid 37 grader under 2 timmar till över natten. Obs: Inkubera inte i koldioxidinkubator vid 37 grader. Under färgningsperioden bör färgutvecklingen observeras i tid. Om uttrycket av -galaktosidas i provet är högt kan färgningen slutföras inom några timmar. Om uttrycket av -galaktosidas var lågt, bör inkubationstiden förlängas på lämpligt sätt, under vilken 6-brunnsplattan ska förseglas med plastfolie eller parafilm för att förhindra att vätskeavdunstning påverkar färgningsresultaten.

(4) Under det vanliga ljusmikroskopet avlägsnades färgningslösningen efter att de positiva cellerna utvecklat färg. Om kärnor behöver motfärgas, tillsätt en liten mängd Nuclear Fast Red-lösning (G1035 rekommenderas) till brunnsplattan för att täcka cellerna och färga vid rumstemperatur i 3 minuter, ta bort färgningslösningen och tvätta med PBS flera gånger.

(5) 2 ml PBS tillsattes för att täcka cellerna och färgningen fullbordades. Provet kunde lagras vid 4 grader i 1 vecka. Eller tillsätt 70% glycerol för att täcka cellerna, 4 grader kan lagras under lång tid. Om det är cellklätterlakanet, kan klätterlakanet torkas helt, xylengenomskinligt efter att ha tappat neutralt gummitätningsark, kan lagras under lång tid.

2. För frysta sektioner

(1) Värm upp frysta sektioner vid rumstemperatur i 10 min. Cirkla vävnaden med vävnadsdrag.

(2) En lämplig mängd fixeringslösning för -galaktosidasfärgning sattes till vävnaden för att helt täcka vävnaden, och lösningen fixerades vid rumstemperatur under 20 minuter.

(3) Vävnadssektionerna blötlades och tvättades i PBS under 3 gånger, 5 minuter varje gång.

(4) Sektionerna placerades i en våt låda för att undvika ljus, och en lämplig mängd -galaktosidasfärgningslösning sattes till vävnaden för att helt täcka vävnaden. Den våta lådan inkuberades vid 37 grader och färgutvecklingen observerades under ett mikroskop varannan timme. Om ingen färgutveckling observerades, fortsatte odlingen tills de åldrande cellerna på vävnaden visade färg. Om provet ska inkuberas över natten bör en tillräcklig mängd -galaktosidasfärgningslösning tillsättas för att förhindra att färgningslösningen avdunstar och torkar tabletterna.

(5) Efter att vävnaden utvecklat färg, avlägsnades färgningslösningen och sektionerna nedsänktes i PBS och tvättades två gånger och nedsänktes sedan i rent vatten och tvättades två gånger.

(6) (valfritt) Tillsätt Nuclear Fast Red-lösning (G1035 rekommenderas) i 3 min och tvätta i 3 gånger.

(7) Sektionerna dehydratiserades med absolut etanol under 2 gånger, sedan genomskinliga med xylen under 5 minuter varje gång och förseglades sedan med neutral gummidropp.

3. Färgningsresultat

Cytoplasman hos åldrande celler är spridd blå.

 

 

1. X-Gal lösning ska tinas och blandas helt i rumstemperatur före användning.

2. -galaktosidasfärgningslösning A och B bör återställas till rumstemperatur i förväg före användning, och den beredda färgningslösningen ska blandas noggrant utan utfällning före användning.

3. -galaktosidasfärgningsreaktionen hos åldrande celler är beroende av specifika pH-förhållanden, så den kan inte inkuberas i en CO₂inkubator för färgutveckling, annars kommer det att påverka färgningslösningens pH och leda till färgningsfel.

4. När du förbereder färglösning, välj förbrukningsvaror gjorda av polypropen (PP) eller glas istället för polystyren (PS).

5. Färgutvecklingen bör observeras flera gånger under färgutvecklingsperioden på 2 timmar över natten, för kort tid kan leda till negativa resultat; för mycket tid kan leda till falska positiva resultat. Den kromogena tiden är nära relaterad till mängden -galaktosidas som finns i själva provet.

6. Innan du förbereder färgningslösningen, kontrollera pH-värdet för färgningslösning A. Om det inte är 6.0 (vilket kan ändras på grund av lagringsförhållanden), justera pH-värdet till 6.{{4} } med HCl eller NaOH före användning.

7. -galaktosidasfärgning av vävnadssnitt kräver hög förberedelse av prover, som bör förvaras i -80 grad och testas så snart som möjligt. Eftersom -galaktosidas är mycket lätt att inaktivera, kan felaktig förvaring eller för lång tid av provet leda till enzyminaktivering, då ingen positiv färgning.

8. Bär en labbrock och engångshandskar under drift

 

Bilder:

 

Fig. 1WI-38-celler färgades med -galaktosidas-kit. Den vänstra bilden visar senescens WI-38-celler utan delning och spridningsförmåga men fortfarande vid liv. Efter färgning var de positiva färgningscellerna mer än 95 %. Bilden till höger visar nyligen återupplivade WI-38-celler (tidig passage) med mindre än 3 passager och inga uppenbara positiva celler efter färgning.

 

Endast för forskning!

 

 

Populära Taggar: åldrande cell-galaktosidasfärgningskit, Kina åldrandecell-galaktosidasfärgningssats tillverkare, leverantörer, fabrik