Click-iT EdU-488 Cell Proliferation Detection Kit

 

produktnamn	Identifiering av produkt	modell
Click-iT EdU-488 Cell Proliferation Detection Kit	G1601	100T

 

 

Att analysera cellproliferationsförmåga är en vanlig och viktig utvärderingsmetod inom biovetenskap. Den kan bedöma påverkan av vissa gener, läkemedel etc. på celler som odlats in vitro, eller analysera vävnadscellers tillväxt och förnyelseförmåga under olika förhållanden eller stimulering. För närvarande finns det många metoder för att detektera cellproliferation. De flesta av dem använder vissa metaboliska enzymer som produceras av celler för att indirekt bedöma cellproliferationsaktivitet (som CCK-8-metoden, MTT-metoden, etc.), men vissa läkemedel eller själva cellens tillstånd kommer att ha en viss inverkan på resultatet av bedömningen. Direkt detektering av DNA-syntes i celler för att bestämma cellproliferation anses vara den mest exakta och effektiva detektionsmetoden. Men både den ursprungliga radiomärkta nukleosidinkorporeringsmetoden och den efterföljande förbättringen av BrdU-metoden baserad på antikroppsdetektion har sina egna begränsningar.

EdU (5-Ethynyl-2'-deoxiuridin, 5-ethynyl-2'-deoxiuridin) är en tymidinanalog som innehåller en acetylengrupp, när den injiceras i djur eller inkuberar celler odlade i vitro kan dessa små molekyler snabbt diffundera till olika organ och vävnader och infiltrera in i cellerna och kan ersätta tymidin (T) till nysyntetiserat DNA under cellproliferation. Acetylengruppen i EdU-molekylen kan reagera med den fluorescerande iF488-märkta azidföreningssonden för att bilda en stabil triazolring under katalys av kopparjoner, så det nysyntetiserade DNA:t kan märkas med motsvarande fluorescerande sond. Jämfört med den radiomärkta nukleosidinkorporeringsmetoden har EdU-detekteringsmetoden inga begränsande faktorer såsom radioaktiv kontaminering; jämfört med BrdU-detektionsmetoden kräver EdU-detektionsmetoden inte DNA-denaturering eller antigen-antikroppsreaktion, vilket avsevärt minskar komplexiteten i experimentet och även gör experimentet mer tidsbesparande, känsligare, stabilare och mer exakt.

Detta kit kan användas för att detektera cellproliferation i odlade celler eller djurvävnader. Den fluorescerande sonden i detta kit är grön fluorescens, den maximala excitationsvåglängden är 491 nm och den maximala emissionsvåglängden är 516 nm. Efter att de prolifererande cellerna är märkta kommer cellkärnan att visa ljusgrön fluorescens, och cellkärnan kommer att märkas tillsammans med det matchande konventionella kärnfärgämnet (Detta kit ger Hoechst 33342 cellkärnfärgämne), du kan använda fluorescensmikroskop, konfokalt lasermikroskop och andra instrument för att direkt observera cellproliferation; Du kan också använda flödescytometri för att upptäcka fluorescensintensiteten hos odlade celler in vitro och sedan bestämma cellcykeln baserat på fluorescensintensitetens DNA-replikationsaktivitet i mitten av S-fasen.

 

 

Reagens B(iF488 färgämne) bör förvaras i -20 grad borta från ljus;

EdU katalytiskt reagens (reagens A) och reaktionsbuffert kan lagras vid 4 grader;

Gäller i 12 månader.

 

 

Komponentnummer	Komponent	G1601-100T
G1601-1	EdU lagringslösning (10 mM)	100 μL
G1601-2	Reagens A	120 μL
G1601-3	Reagens B (iF488 färgämne)	50 μL
G1601-4	Reagens C	2 × 100 mg (pulver)
G1601-5	reaktionsbuffert	20 ml
G1601-6	Hoechst 33342 färgningslösning	30 μL
Manuell		1 st

Obs! Ovanstående reaktionstid är för motsvarande 96-brunnsplattaanalys.

 

 

1. Cellodlingsmedium innehållande serum;

2. Permeabiliseringslösning: 0.2-0.5% Triton X-100 i PBS(rekommenderar vår produkt, Kat.#:G1204);

3. Fixiativ lösning: 4% paraformaldehyd i PBS, pH 7,4 (rekommenderar vår produkt, Kat. #:G1101);

4. PBS-buffert (rekommenderar vår produkt, Cat.#:G4202);

5. Ultrarent vatten;

6. Djurmodellering och vävnadssnittningsrelaterade reagenser (analys av djurvävnadscellproliferation).

 

 

1. Förbehandling av odlade celler in vitro:

1.1. Plantera cellerna jämnt i cellodlingsplattan vid en viss densitet (planteringsdensiteten bestäms av faktorer som cellstorlek, tillväxthastighet etc.). Efter att cellerna fäster vid väggen eller återgår till ett normalt tillstånd, utför motsvarande läkemedelsstimulering och andra behandlingar. (För suspensionsceller, följ den normala driftmetoden för suspensionsceller. Hela experimentet måste lägga till centrifugering och andra steg).

1.2. Den katalytiska tillsatsen (reagens C) centrifugerades vid låg hastighet, 100 mg togs och löstes genom tillsats av 1 ml ultrarent vatten och dispenserades och lagrades vid -20 grad, det återstående pulvret behölls som reserv.

 

2. In vitro cellulär EdU-märkning, fixering och permeabilisering:

2.1. Förbered 2×EdU inkubationsarbetslösning: tillsätt 2 μL EdU lagringslösning (10 mM) till varje 1 mL komplett cellodlingsmedium, vilket är 20 μM 2×EdU inkubationsarbetslösning, och lägg den i inkubatorn för att förvärma (rekommenderas EdU arbetskoncentration är 10 μM för preliminära experiment);

2.2. I halvförändringsläget, aspirera hälften av det ursprungliga cellodlingsmediet i odlingsplattan och tillsätt en lika stor volym av förvärmd 2×EdU-inkubationsarbetslösning och inkubera under en viss tid (varaktigheten av inkubationen beror i allmänhet på på tillväxtcykeln för motsvarande celler, som vanligtvis står för cirka 10 % av cellcykeln. För mestadels vidhäftande och snabbväxande celler är inkubation under cirka 2 timmar För specifika fall behöver den anpassas med cellegenskaperna, den faktiska situationen efter behandling etc. Om en längre inkubationstid krävs kan EdU-arbetskoncentrationen reduceras på lämpligt sätt under en kortare tid ökas på lämpligt sätt);

2.3. Efter EdU-inkubation, tvätta med PBS-buffert i 1-2 gånger, tillsätt fixeringsvätska för att täcka cellerna och fixera vid rumstemperatur i 15 minuter (om flödescytometri krävs ska de vidhäftande cellerna smältas och återsuspenderas före detta steg fixa, följ bearbetningsmetoden för suspensionsceller); Tvätta 2-3 gånger med PBS-buffert, 3-5 min varje gång;

2.4. Ta bort PBS-bufferten, tillsätt permeabiliseringslösning för att täcka cellerna och inkubera vid rumstemperatur i 15 minuter;

2.5. Ta bort permeabiliseringslösningen, tvätta 1-2 gånger med PBS-buffert, 3-5 min varje gång. Gå sedan till steg 4.

 

3. Djurs EdU-injektionsmodellering såväl som bearbetning av vävnadssnitt:

3.1. Enligt experimentella krav används en eller flera EdU-injektioner för att modellera djur genom intraperitoneal injektion, intramuskulär injektion, subkutan injektion, svansvensinjektion, etc. Generellt är förhållandet mellan EdU-dosering och djurets kroppsvikt 5 mg/kg, den faktiska injektionsdosen beror på forskningsinnehållet och djurförhållandena. EdU-lagringslösningen som tillhandahålls i detta kit används huvudsakligen för in vitro-cell EdU-märkning. Om du behöver modellera ett djur med EdU kan du beställa EdU-reagenset separat (kat.nr: G5059);

3.2. Epitelceller som tunntarmen förökar sig snabbt, medan hjärnceller förökar sig långsamt. De snabbare växande vävnaderna tar vanligtvis mindre än 12 timmar för märkning, medan de långsammare växande vävnaderna kan ta flera dagar för märkning. Den optimala märkningstiden bestämdes enligt det specifika experimentet. På grund av den snabba spridningen av tarmepitelvävnad rekommenderades sådan vävnad som referens för märkning.

3.3. Efter att djuret avlivats enligt de specificerade standarderna, tas de vävnader som behövs ut och frysta snitt eller paraffinsnitt görs enligt de konventionella procedurerna:

a. För frysta sektioner: återställ sektionerna till rumstemperatur, tillsätt en lämplig mängd fixeringsvätska och fixera i rumstemperatur i 15 minuter. Ta bort fixeringsvätskan och tvätta 3 gånger med PBS-buffert i 3-5 min vardera; ta bort PBS-bufferten och täck vävnaden med en lämplig mängd permeabiliseringslösning och inkubera vid rumstemperatur i 10-15 min; ta bort permeabiliseringslösningen och tvätta med PBS-buffert 1- 2 gånger, 3-5 min varje gång. Gå sedan till steg 4.

b. För paraffinsektioner: Avparaffinera och rehydrera sektionerna och tvätta med PBS i 5 min. Ta bort PBS-bufferten, tillsätt permeabiliseringslösning för att täcka cellerna eller vävnaderna och inkubera vid rumstemperatur i 15 minuter; Tvätta sedan med PBS-buffert i 1-2 gånger, varje gång i 3-5 min. Gå sedan till steg 4.

 

4. EdU-klickreaktion:

4.1. Under cell- eller vävnadsfixering och perforering, beredning av reaktionslösning: blanda reagenserna enligt följande förhållande, beredningsvolymen kan ökas eller minskas i proportion till antalet prover.

 

Komponent	Volym (för cell)	Volym (för histologisk sektion)
reaktionsbuffert	935 μL	928 μL
Reagens A	10 μL	10 μL
Reagens B (iF488 färgämne)	5 μL	12 μL
Reagens C	50 μL	50 μL
total kapacitet	1000 μL	1000 μL

 

4.2. Ta bort PBS-bufferten från cellerna eller sektionerna, tillsätt reaktionslösningen, skaka försiktigt för att säkerställa att reaktionslösningen täcker alla celler eller vävnader och inkubera i 30 minuter vid rumstemperatur i mörker;

4.3. Ta bort reaktionslösningen, tvätta 2-3 gånger med PBS-buffert, 3-5 min varje gång (Om det inte finns några andra speciella krav kan fluorescensintensiteten detekteras med flödescytometri eller så kan fluorescenseffekten detekteras genom andra instrument).

 

5. Kärnfärgning (valfritt):

5.1. Späd Hoechst 33342-färgningslösning med PBS-buffert i ett förhållande av 1:500-1000, tillsätt till provet för att täcka cellerna och inkubera i 5 minuter;

5.2. Ta bort Hoechst 33342-färgningslösning, tvätta 2-3 gånger med PBS-buffert, 3-5 min varje gång.

6. Avbildnings- och detektionsanalys:

Använd fluorescensmikroskop eller konfokalmikroskop för att detektera bearbetade celler eller vävnadssektionsprover och analysera andelen prolifererande celler. Alternativt kan celler som odlats in vitro samlas in och fluorescensintensiteten kan mätas med flödescytometri (det rekommenderas att använda cellprov som inte är märkta med EdU som en negativ kontroll för flödescytometrianalysen och för att välja lämplig spänning), och baserat på på fluorescensintensiteten kan DNA-replikationsaktiviteten för S-fasen i cellcykeln bestämmas. Det fluorescerande färgämnet iF488 (Reagens B) i detta kit motsvarar spektralkarakteriseringen av Ex/Em: 491 nm/516 nm (grön); Hoechst 33342 färgningslösning motsvarar den spektrala karakteriseringen av Ex/Em: 346 nm/460 nm (blå).

 

 

1. För odlade celler kan den specifika EDU-koncentrationen och inkubationstiden justeras på lämpligt sätt beroende på provet och forskningsändamålet.

2. Vissa vävnadsceller förökar sig långsamt. För att undvika dålig modelleringseffekt rekommenderas det att välja vävnadsprover med snabb proliferation som referensprov (t.ex. tarmvävnad).

3. Om bakgrundsfärgen är för mörk kan det bero på otillräcklig tvättning, lång tid fixerad och kvarvarande fixeringsmedel etc. i experimentet.

4. Reagens C (EdU katalytisk additionsreagens) är lätt att oxidera. Försök att undvika långvarig exponering för luften. Efter att ha framställts som en vattenlösning rekommenderas det att lagra i alikvot; Testat, såsom EdU katalytisk tillsats reagens färg ändras något, klick reaktion katalytiska systemet kan fortfarande fortsätta normalt. om reagens C ser brunt ut indikerar det att komponenten har gått ut, så kassera den.

5. För din hälsa och säkerhet, vänligen bär labbrockar och handskar under drift.

 

Endast för forskning!

 

 

Populära Taggar: click-it edu-488 cellproliferationsdetektionskit, Kina click-it edu-488 cellproliferationsdetektionskit tillverkare, leverantörer, fabrik